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摘要:动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)起病急､病情重,具有较高病死率和致残率｡早期脑损伤(EBI)是影响aSAH患者急性期病情进展和远期预后的重要因素,其机制涉及血-脑屏障破坏､微循环障碍､脑水肿､神经炎症､血红蛋白降解产物毒性､铁稳态紊乱及程序性细胞死亡等｡该文对aSAH后发生EBI的关键病理环节中可检测的相关分子标志物及具有干预潜力的通路进行了综述,以期为高危患者早期识别和治疗靶点选择提供参考｡
动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmal SAH,aSAH)是神经外科常见危重症之一,具有较高病死率和致残率[1]｡随着动脉瘤夹闭和血管内治疗技术的发展,动脉瘤再破裂的防治效果明显改善,但部分aSAH患者仍因早期脑损伤(early brain injury,EBI)､脑血管痉挛､迟发性脑缺血(delayed cerebral ischemia,DCI)､脑积水及全身并发症导致预后不良[1]｡2023年美国心脏协会/美国卒中协会指南指出,aSAH治疗应重视动脉瘤闭塞后的神经重症管理,但目前有效改善患者长期预后的神经保护措施较为有限[1]｡
EBI通常指动脉瘤破裂后72h内发生的脑组织损害,是影响aSAH患者预后的重要早期病理过程,其机制涉及微循环障碍､血-脑屏障破坏､脑水肿､神经炎症､氧化应激､血红蛋白降解产物毒性､铁稳态紊乱及程序性细胞死亡等,上述病理改变相互影响,可加重aSAH后继发性脑损伤,增加DCI(多发生于aSAH后4~14d,主要表现为排除其他原因后新出现的局灶性神经功能缺损或意识水平下降,是影响aSAH患者神经功能结局的重要并发症)和不良预后发生风险[2-3]｡因此从EBI关键病理环节中筛选具有干预潜力的生物标志物可能有助于早期识别EBI高危患者并为其治疗靶点选择提供依据｡
笔者拟对aSAH后EBI关键病理环节相关的分子标志物与可干预通路进行综述,包括可在血液､脑脊液或组织中检测并反映EBI病理活动的分子标志物,已有基因学､药理学或临床干预依据的治疗靶点及可干预通路,可动态反映血-脑屏障､血管内皮或神经功能损伤的监测指标等｡
1 血-脑屏障破坏
血-脑屏障破坏是aSAH后EBI发生的重要病理环节[4]｡蛛网膜下腔积血､凝血酶､血红蛋白降解产物和炎症因子均可诱导基质金属蛋白酶(MMP)表达,其中MMP-9可降解Ⅳ型胶原､层黏连蛋白及紧密连接相关蛋白,破坏基底膜和血管内皮连接结构,增加血管通透性,破坏血-脑屏障,促进脑水肿形成[4]｡Triglia等[5]纳入30例重症aSAH患者,动态检测发病48h内血浆和脑脊液MMP-9水平,结果显示,aSAH后发生DCI患者(16例)入院后24h内脑脊液MMP-9浓度高于未发生DCI患者[14例;47(21,102)μg/L比4(2,13)μg/L,P= 0.001],入院后24h内脑脊液MMP-9水平预测DCI的受试者工作特征曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.91,截断值为14.3μg/L,敏感度为88%,特异度为86%｡
Vellimana等[6]将小鼠SAH模型分别于造模前2h､造模后1h腹腔注射45mg/kg米诺环素,每12h重复给药1次,结果显示,相较于等渗盐水对照组,不同给药时间小鼠SAH造模后1~3d MMP-9活性均降低,造模后第3天大脑中动脉痉挛均减轻(均P<0.05);经神经功能评分､转棒实验及纤维蛋白原组织化学染色评估,不同给药时间小鼠SAH造模后1~3d神经功能缺损､造模后第3天纤维蛋白原阳性微均较等渗盐水对照组减少(均P<0.05),提示米诺环素具有一定的治疗时间窗｡MMP-9可于外周血浆及脑脊液中检测且直接参与基底膜和紧密连接降解,兼具EBI相关分子标志物和可干预分子属性,但米诺环素并非MMP-9特异性抑制剂,目前尚缺乏aSAH患者靶向MMP-9治疗的相关证据｡
紧密连接蛋白5､S100B､神经丝轻链蛋白可反映血-脑屏障或神经损伤;多配体蛋白聚糖1､透明质酸等血管糖萼降解相关指标可反映血管内皮损伤[2]｡Kapapa等[7]纳入12例SAH患者和11例对照者(其他神经系统疾病),动态监测血浆和脑脊液相关标志物,结果显示,SAH患者出血后第1､2､3天S100B水平均高于对照者(均P<0.05),且紧密连接蛋白5､神经丝轻链蛋白水平呈动态变化｡Bell等[8]对3例aSAH后发生DCI患者的血浆和脑脊液相关标志物进行检测,结果显示,DCI发生时血浆多配体蛋白聚糖1较DCI发生前基线水平升高(1.41±0.14)倍(P<0.05)｡Schick等[9]研究结果显示,aSAH患者(18例)出血后第1天血浆透明质酸水平较健康对照者(40名)升高[131(84, 179)μg/L比92(82,98)μg/L,P=0.009],且aSAH后发生脑血管痉挛患者(10例)出血后第7天血浆透明质酸水平高于未发生脑血管痉挛患者[8例;206(165, 288)μg/L比133(108,164)μg/L,P= 0.009]｡上述指标可反映血管内皮损伤情况,或可作为aSAH后血管内皮损伤及相关DCI､脑血管痉挛的动态监测指标,但目前尚缺乏相关特异性药物干预的明确证据｡
2 微循环障碍与血栓炎症反应
aSAH后微循环功能障碍及血栓炎症反应同样参与EBI,其机制可能涉及血管张力调节､内皮-血小板相互作用及微血栓形成等[2]｡
2.1 内皮素1和内皮素A受体
aSAH后脑血管痉挛与微循环障碍共同影响脑组织灌注[10]｡内皮素1为强效血管收缩肽,可于血液或脑脊液中检测,内皮素A受体为aSAH后脑血管痉挛药物治疗靶点[11]｡Endo等[12]分别纳入行介入栓塞和显微外科夹闭术的aSAH患者各221例,于出血后48h内开始持续静脉滴注选择性内皮素A受体拮抗剂克拉佐森坦10mg/h或给予安慰剂,两组中位给药时间均为12d,结果显示,行介入栓塞术患者中,克拉佐森坦组与安慰剂组aSAH患者发病后6周内复合终点(脑血管痉挛相关并发症或死亡)的发生率分别为13.6%(14/103)和28.8%(32/111),与安慰剂组比较,克拉佐森坦组相对风险降低53%(95%CI:17%~73%,P=0.0055);行显微外科夹闭术患者中,克拉佐森坦组与安慰剂组aSAH发病后6周内复合终点发生率分别为16.2%(17/105)和39.6%(42/106),与安慰剂组比较,克拉佐森坦组相对风险降低59%(95%CI:33%~75%, P=0.0001)｡
Mayer等[13]纳入74个中心共409例行显微外科夹闭或介入栓塞治疗的aSAH患者,结果显示,克拉佐森坦组(发病96h内静脉滴注克拉佐森坦15mg/h,中位给药时间12.0d)和安慰剂组(中位给药时间12.9d)给药后14d内DCI所致神经功能恶化(改良格拉斯哥昏迷量表或美国国立卫生研究院卒中量表评分较基线升高≥2分并持续≥2h)患者比例差异无统计学意义[15.8%(32/202)比17.2%(35/204),P= 0.734];克拉佐森坦组行脑血管痉挛救援治疗(球囊扩张血管成形术或动脉内､鞘内､脑池内或脑室内给予血管扩张剂)的患者比例低于安慰剂组[10.4%(21/202)比18.1%(37/204)],克拉佐森坦组的相对风险降低42.6%(95%CI:5.4%~65.2%);发病后12周,两组不良神经功能结局(改良Rankin量表评分≥3分或改良格拉斯哥结局量表评分≤4分)患者比例差异无统计学意义[24.8%(50/202)比20.1%(41/204),P=0.198]｡上述两项研究表明,阻断内皮素A受体介导的信号通路可减轻aSAH患者血管痉挛,但是否可减少DCI发生,进而增加患者远期神经功能获益尚待验证｡此外,克拉佐森坦相关低血压､液体潴留､胸腔积液或肺水肿可能影响患者耐受性,重症aSAH患者应用克拉佐森坦时需结合心肺功能和液体容量管理进行风险-获益评估｡
2.2 一氧化氮､内皮型一氧化氮合酶及诱导型一氧化氮合酶
一氧化氮是维持脑血管舒张和微循环灌注的重要分子,aSAH后游离血红蛋白迅速清除一氧化氮,血管内皮损伤降低内皮型一氧化氮合酶活性,炎症刺激使诱导型一氧化氮合酶过度表达,导致保护性一氧化氮生物利用度下降与炎症性一氧化氮过度生成并存[2]｡Sehba等[14]构建大鼠SAH模型后10min采用Griess法检测脑组织亚硝酸盐和硝酸盐水平,结果显示,与正常大鼠(9只)相比,SAH模型大鼠(6只)脑干､小脑及腹侧凸面皮质等脑区一氧化氮代谢物水平均降低(均P<0.05)｡Vellimana等[15]于小鼠SAH造模前行低氧预适应,于造模后第2天采用明胶-印度墨水脑血管铸型并测量穿刺侧近端大脑中动脉直径以评估血管痉挛程度,结果显示,野生型SAH小鼠中,低氧预适应组(17只)血管痉挛程度较未低氧预适应组(12只)减少(94±19)%(P<0.05),而在内皮型一氧化氮合酶敲除SAH小鼠中,低氧预适应组(20只)血管痉挛程度仅较未低氧预适应组(19只)减少(24±20)%(P<0.05)｡Lenz等[16]于SAH造模后3h采用活体双光子显微镜观察SAH小鼠脑微循环及微动脉痉挛,结果显示,一氧化氮合酶敲除SAH小鼠的微动脉痉挛数量较野生型SAH小鼠增加40%(P=0.04),且造模后3h病死率高于野生型SAH小鼠[48%(12/25)比0(0/16),P<0.01]｡上述低氧预适应及基因敲除仅为SAH机制研究,并不能体现aSAH后的干预疗效或治疗时间窗｡
一项研究回顾性纳入18例重症aSAH患者,予持续静脉注射吗多明抗血管痉挛,经颅多普勒超声提示发生严重大血管痉挛时经脑室外引流管注射硝普钠2~10mg/次[平均(5.6±2.5)mg/次],部分连续注射硝普钠2~3次,其中夜间1次/3~4h;结果显示,硝普钠治疗后患者经颅多普勒超声监测大脑中动脉和大脑前动脉平均血流速度分别较给药前下降43%[(100±44)cm/s]和52%[(96±56)cm/s;均P<0.01][17]｡有研究将小鼠于SAH造模后1h吸入2%异氟烷1h或于造模后即刻及造模后第1､2天腹腔注射选择性诱导型一氧化氮合酶抑制剂1400W 10mg/kg,并通过测量大脑中动脉直径､纤维蛋白原免疫荧光染色及神经功能评分评估小鼠大动脉痉挛､微血栓及神经功能缺损情况,结果显示,两种干预方式均可减轻小鼠造模第3天大动脉痉挛､微血栓及神经功能缺损,且诱导型一氧化氮合酶基因敲除SAH小鼠中,异氟烷的上述作用均未见增强,提示其作用可能与抑制诱导型一氧化氮合酶有关[18]｡
2.3 血管性血友病因子(vWF)/含血小板反应蛋白1型基序的解整合素和金属蛋白酶13(ADAMTS13)信号通路
vWF由内皮细胞和巨核细胞产生,内皮激活或损伤后可释放超大分子多聚体并介导血小板黏附､聚集;ADAMTS13可裂解超大分子vWF,降低其促血栓形成活性;vWF升高与ADAMTS13相对不足可共同促进aSAH后的微血栓形成[19]｡Kumar等[20]对40例SAH患者和40名健康对照者的血浆vWF抗原､vWF活性及ADAMTS13活性进行检测,结果显示,相较于健康对照者,SAH患者出血后0､1､3､5､7､10d血浆vWF抗原和活性均更高(均P<0.01),ADAMTS13活性均更低(均P<0.01),提示SAH患者该信号通路持续失衡｡
Wan等[21]于小鼠SAH后5min经尾静脉注射3460U/kg重组ADAMTS13,并于干预后2h采用免疫组织化学染色和免疫荧光共染评估小胶质细胞活化和神经元损伤程度,结果显示,与未接受重组ADAMTS13治疗的野生型SAH小鼠相比,干预组SAH小鼠小胶质细胞活化面积降低[(2.9±0.9)%比(3.7±0.6)%,平均差值-22%;95%CI:-3%~-39%],神经元数量减少[45(9,115)个比185(133,353)个, P<0.01]｡上述研究结果表明,vWF/ADAMTS13信号通路与SAH后EBI之间可能存在关联,但该研究采用的5min治疗窗口可能并不符合临床实际,后续尚需探索延迟给药和重复给药方案｡
2.4 中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)/脱氧核糖核酸酶(DNase)Ⅰ/肽酰精氨酸脱亚胺酶4信号通路
NETs由去凝聚染色质､瓜氨酸化组蛋白H3､髓过氧化物酶等成分构成,可促进血小板黏附､凝血激活和微血栓形成;肽酰精氨酸脱亚胺酶4参与NETs形成,DNaseⅠ可降解NETs的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)骨架[22]｡
Hao等[23]研究显示,小鼠SAH模型中瓜氨酸化组蛋白H3信号与纤维蛋白原阳性微血栓信号在同一空间区域重叠出现,即NETs标志物出现在微血栓所在位置;造模后1h行DNaseⅠ干预(腹腔注射50μg后再静脉注射10μg),结果显示,与等渗盐水对照组相比,DNaseⅠ干预24h后SAH小鼠免疫荧光检测的NETs和微血栓均减少,脑含水量及伊文思蓝外渗量均降低,改良Garcia神经功能评分和平衡木实验结果均改善(均P<0.05)｡Zeineddine等[24]在小鼠SAH造模前15min或造模后3d单次腹腔注射3.33mg/kg肽酰精氨酸脱亚胺酶4抑制剂Cl-amidine,脑组织免疫染色､尼氏染色及神经功能评分结果显示,与等渗盐水对照组相比,两种干预时间应用Cl-amidine均可降低小鼠SAH造模后第7天血管内NETs水平,减小脑梗死体积,并改善神经功能(均P<0.05);合并两种给药方案(即造模前15min和造模后3d均给药)后,SAH小鼠迟发性神经功能恶化(神经功能评分较此前最佳水平下降≥5分)发生率低于等渗盐水对照组[5.0%(1/20)比30.0%(6/20),P=0.0389]｡
Hendrix等[25]纳入76例aSAH患者并分为DCI组(28例)和非DCI组(48例),入院当日及入院后第4天定量检测游离DNA水平和DNaseⅠ活性,结果显示,与入院当日相比,入院后第4天DCI组游离DNA水平由793(618,1090)μg/L升至1266 (1064,1816)μg/L,非DCI组由752(585, 908)μg/L升至1284(885,1513)μg/L,差异均有统计学意义(均P<0.01);相较于入院当日,入院后第4天DCI组DNaseⅠ活性下降[42.7(35.5,54.7)比52.1(40.7, 62.1), P=0.001],非DCI组差异无统计学意义(P=0.067)｡目前NETs/DNaseⅠ/肽酰精氨酸脱亚胺酶4信号通路作为SAH治疗靶点的证据主要来自动物实验,未来或可作为临床上aSAH后NETs相关血栓炎症动态监测指标｡
3 脑水肿
脑水肿是aSAH后EBI的常见病理表现,其形成涉及血管通透性改变和细胞离子､水稳态异常等,针对上述机制的相关干预已成为减轻aSAH后早期脑水肿的重要研究方向[26]｡
3.1 缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路
aSAH后颅内压骤升､脑灌注压下降和微循环障碍可造成脑组织缺血缺氧,促使缺氧诱导因子1α稳定表达,并上调VEGF等下游分子[27-28]｡VEGF主要通过VEGFR-1和VEGFR-2介导血管生成及血管通透性,其中VEGFR-2与血管通透性增加和血管源性脑水肿关系密切[27-28]｡
Wu等[27]于大鼠SAH造模后24h采用蛋白检测､脑含水量检测､伊文思蓝外渗､原位末端转移酶标记法染色及神经功能评分分别评价治疗组(SAH造模后1h腹腔注射2-甲氧基雌二醇5mg/kg)与对照组(无干预)缺氧诱导因子1α和VEGF表达､脑水肿､血-脑屏障通透性､细胞凋亡及神经功能损害情况,结果显示,治疗组SAH大鼠上述指标均较对照组改善(均P<0.05)｡Liu等[28]于小鼠SAH造模后30min经侧脑室单次注射抗VEGF抗体(0.2μg或1.0μg)或抗VEGFR-2抗体(2.0μg),结果显示,与磷酸盐缓冲液对照组(SAH造模后30min经侧脑室注射2μl无菌磷酸盐缓冲液)相比,1.0μg抗VEGF抗体组SAH后24~48h改良Garcia神经功能评分改善,干湿重法测定的脑含水量降低(均P<0.05);免疫组织化学染色显示,SAH后24h脑组织免疫球蛋白G外渗减少(P<0.05);与磷酸盐缓冲液对照组相比,2.0μg抗VEGFR-2抗体组SAH后24h改良Garcia神经功能评分改善,左侧大脑半球脑含水量降低(均P<0.05),同时VEGFR-2､磷酸化VEGFR-2及肌腱蛋白C表达均降低(均P<0.05),提示VEGF/VEGFR-2信号通路可能参与SAH后EBI,但超早期脑室内给药可能限制其临床转化｡
Cai等[29]前瞻性纳入257例aSAH患者和100名健康对照者,结果显示,aSAH患者急诊检测的中位血清缺氧诱导因子1α水平高于健康对照者(288.0ng/L比102.6ng/L,P<0.01),其预测aSAH后DCI和发病后6个月不良预后(扩展格拉斯哥预后量表评分1~4分)的AUC分别为0.751和0.791(均P<0.01),提示血清缺氧诱导因子1α对aSAH患者病情评估和风险分层具有一定价值,但其并非EBI程度的直接评价指标｡
3.2 磺脲类受体1-瞬时受体电位美拉他汀4(SUR1-TRPM4)通道
SUR1-TRPM4是急性脑损伤后脑水肿形成的重要离子通道复合体,SAH后缺血､炎症､内皮损伤和能量代谢障碍可诱导SUR1-TRPM4表达上调,增加Na+等单价阳离子内流,导致细胞肿胀,血-脑屏障破坏和脑水肿加重[30]｡
格列本脲可阻断SUR1-TRPM4通道[31]｡Kajimoto等[31]研究显示,与对照组SAH大鼠(8只)相比,格列本脲组SAH大鼠(造模后即刻皮下泵入格列本脲24h,总量39.52μg;8只)造模后24h脑含水量降低[(69±9)%比(90±19)%,P<0.01],且皮质白细胞介素(IL)1β和肿瘤坏死因子α均下调(均P<0.05),Iba-1免疫组织化学染色显示活化型小胶质细胞活化抑制;与对照组SAH大鼠相比,格列本脲组造模后24h血糖由造模前(167.8±16.7)mg/dl降至(131.4±35.7)mg/dl(P=0.035;1mg/dl=0.056mmol/L),且未见异常低值｡Lin等[32]纳入111例发病48h内aSAH患者,分为格列本脲组(57例;常规治疗+口服格列本脲3.75mg/d,治疗7d)和对照组(54例;仅接受常规治疗),结果显示,格列本脲组治疗后第3､7天血清神经元特异性烯醇化酶和S100B水平､中线移位患者比例､灰白质比值及治疗后90d改良Rankin量表评分较对照组均未改善(均P>0.05)｡Feng等[33]将56例aSAH患者随机分为格列本脲组(28例;常规治疗+口服格列本脲15mg/d)和安慰剂组(28例;常规治疗+ 口服维生素B1),结果显示,治疗第10天,格列本脲组轻度脑水肿(SAH早期脑水肿评分0~2分)患者比例高于安慰剂组[60.7%(17/28)比42.9%(12/28),校正OR= 4.66,95%CI:1.14~19.10,P=0.032],但格列本脲组4例患者发生低血糖｡综上所述,SUR1-TRPM4通道具有较明确的脑水肿靶向干预依据,但现有临床研究样本量较小,剂量及终点差异较大,尚无明确的远期神经功能获益证据,且高剂量治疗需警惕低血糖风险｡
4 神经炎症
aSAH后神经炎症可由损伤相关信号和先天免疫反应共同驱动,并在EBI过程中持续进展;现有研究主要围绕aSAH后炎症信号及其下游效应环节探索干预靶点[2]｡
4.1 高迁移率族蛋白B1(HMGB1)
HMGB1是一种非组蛋白核结合蛋白,其可在细胞损伤或坏死后被动释放,也可在小胶质细胞､单核或巨噬细胞等免疫细胞活化后主动分泌至细胞外,并作为损伤相关分子模式与Toll样受体4､晚期糖基化终末产物受体等结合,激活核因子κB相关炎症通路[34]｡Chu等[35]分析了48例aSAH患者与12名健康受试者脑脊液,并检测aSAH患者出血后第1~3､4~6､7~9和10~12天HMGB1及可溶性晚期糖基化终末产物受体水平,结果显示,aSAH患者各检测时段HMGB1及可溶性晚期糖基化终末产物受体水平均高于健康受试者(均P<0.05);出血后第1~3天HMGB1≥ 6045.5ng/L是aSAH患者发生DCI的独立预测因素(OR=14.291,P=0.046)｡
HMGB1的靶向治疗依据目前主要来自动物实验｡一项研究将SAH模型大鼠分为对照组(静脉注射免疫球蛋白G)和给药组(静脉注射抗HMGB1单克隆抗体1mg/kg),其中给药组分为正常给药组(造模后5min和24h给药)和延迟给药组(造模后3h和27h给药),以造模前基底动脉直径为100%,CT血管成像显示,SAH后48h对照组基底动脉直径下降至(79.4±1.3)%,延迟给药组下降至(86.4±0.6)%,提示即使延迟给药仍可减轻SAH后基底动脉痉挛[36]｡Ieong等[37]在大鼠SAH后即刻腹腔注射甘草酸15mg/kg,并于6､12和18h后重复给药,SAH后24h免疫荧光､免疫印迹及实时定量聚合酶链反应检测显示,HMGB1表达降低,伊文思蓝外渗减少,酶联免疫吸附分析检测显示肿瘤坏死因子α和IL-1β水平降低,Fluoro-Jade C及原位末端转移酶标记法检测显示神经元损伤减轻(均P<0.05)｡目前尚缺乏aSAH患者抗HMGB1抗体或甘草酸治疗的随机对照研究｡
4.2 髓样细胞触发受体1
髓样细胞触发受体1主要表达于中性粒细胞､单核或巨噬细胞和小胶质细胞,可放大Toll样受体介导的炎症反应[38]｡实验性aSAH后髓样细胞触发受体1表达上调,可增强核因子κB､MMP-9等炎症相关信号,促进IL-1β､IL-6和肿瘤坏死因子α等炎症因子释放,并加重血-脑屏障破坏和脑水肿[38]｡
Sun等[39-40]的系列研究结果显示,SAH大鼠模型的脑内髓样细胞触发受体1水平于造模后6h升高,造模后48h达峰;与未给予髓样细胞触发受体1抑制肽LP17的对照组SAH大鼠相比,造模后1h腹腔注射3.5mg/kg LP17的SAH大鼠24h干湿重法测定的造模侧脑半球脑含水量降低,伊文思蓝外渗减少,72h改良Garcia神经功能评分改善(均P<0.05)｡Wu等[41]研究结果显示,与对照组SAH小鼠(经鼻给予等量超纯水)相比,实验组SAH小鼠(SAH后1h经鼻给予1mg/kg LP17)造模24h后改良Garcia神经功能评分和平衡木试验均显示神经功能改善,干湿重法测定的脑含水量降低,Fluoro-Jade C染色显示损伤神经元减少,免疫荧光检测显示NETs相关标志物减少(均P<0.05)｡临床上,SAH患者可溶性髓样细胞触发受体1水平呈动态变化,提示其可能具有生物标志物潜力,可能为实验性可干预靶点[42]｡
4.3 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)/IL-1β信号通路
NLRP3炎症小体由模式识别受体NLRP3､凋亡相关斑点样蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前体组成,活化后可促进IL-1β､IL-18成熟释放,并通过消皮素D介导细胞焦亡[43]｡Díaz-García等[44]纳入28例aSAH患者和14名健康对照者,结果显示,与健康对照者比较,aSAH患者发病后0~24h外周单核细胞NLRP3阳性率[(26.63±2.97)%比(14.75±1.97)%,P= 0.006]､血清IL-1β水平[(5.60 ± 0.32)ng/L比(2.96±0.24)ng/L,P= 0.026]､外周单核细胞凋亡相关斑点样蛋白阳性率[(35.26±3.86)%比(16.70 ± 2.14)%,P=0.0018]､活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1阳性率[(15.10±3.11)%比(6.02±1.55)%,P=0.0011]及血清IL-18水平[(8.03±2.81)ng/L比(1.59 ± 0.46)ng/L,P=0.0022]均升高,提示炎症小体通路在aSAH后被激活｡
MCC950是选择性NLRP3炎症小体小分子抑制剂[45]｡Dodd等[45]在小鼠SAH后15min腹腔注射40mg/kg MCC950,并根据观察终点采用不同重复给药方案;在观察终点为SAH后24h的急性期实验中,于首次给药12h后追加1次,结果显示,与对照组(给予等渗盐水)相比,MCC950组皮质脑含水量降低[干重:(3.86±0.04)g比(3.43±0.03)g],纤维蛋白原免疫荧光显示微血栓数量减少[(1.76±0.71)个/高倍视野比(5.22±2.20)个/高倍视野;均P<0.05],免疫印迹法显示闭锁蛋白表达升高(0.56±0.08比0.31±0.04,P<0.05);在观察终点为SAH后第5天的延迟期实验中,于第1､3天重复给药,结果显示,MCC950组血管铸型测得的同侧大脑中动脉最窄处直径大于对照组[(101.1±5.2)μm比(77.8±4.1)μm,P<0.05],且角落试验显示感觉运动功能障碍改善｡上述研究结果表明,NLRP3或可作为SAH后可干预的上游炎症靶点,动物实验首次给药时间为SAH后15min,其临床治疗时间窗仍需进一步探索｡
Galea等[46]纳入136例aSAH患者,随机分为对照组(标准治疗;68例)和干预组[标准治疗联合IL-1受体拮抗剂阿那白滞素治疗(发病后3d内开始给药,皮下注射100mg/次,2次/d,持续至发病后21d或出院);68例],结果显示,发病后第3~8天,干预组与对照组血浆IL-6浓度-时间曲线下面积分别为6.37±4.25和11.04±4.02,组间差值为4.48(95%CI:3.28~5.68, P<0.01),C反应蛋白分别为(11.02 ± 6.21)mg/L和(17.02 ± 5.44)mg/L,纤维蛋白原分别为(7.61±1.87)g/L和(8.59 ± 1.71)g/L,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05);干预组16%(10/62)的患者出现注射部位反应,但无研究药物相关严重不良事件(神经系统事件､呼吸道感染､尿路感染等),两组发病后6个月扩展格拉斯哥预后量表评分差异无统计学意义(OR=0.92,95%CI:0.50~1.70,P=0.80),提示以IL-1为干预靶点具有一定的临床转化潜力,其改善远期神经功能结局的疗效仍待进一步验证｡
4.4 补体C5/C5a信号通路
补体系统是aSAH后先天免疫激活的重要组成部分,补体活化后产生C5a可促进炎症细胞募集和小胶质细胞活化,参与神经炎症及继发性脑损伤[47]｡
vanDijk等[47]检测了10例aSAH患者和3例未破裂动脉瘤对照者的脑脊液,结果显示,aSAH患者出血后第1天脑脊液补体C5a水平明显高于对照者[(71.9 ± 26.4)μg/L比(0.05±0.03)μg/L,P< 0.01];同一研究的动物实验部分将SAH小鼠分为野生型SAH组(15只)和C5特异性抗体组(造模后20min腹腔注射C5特异性抗体1mg/只;15只),结果显示,与野生型SAH组相比,C5特异性抗体组造模后48h时Iba1免疫荧光染色阳性面积百分率降低[(6.7±1.0)%比(10.8±2.1)%, P<0.01],裂解型胱天蛋白酶3阳性细胞数减少[(26±16)个比(47±22)个,P≤0.05]｡依库珠单抗是靶向补体C5的单克隆抗体｡Koopman等[48]纳入31例aSAH患者,随机分为依库珠单抗组(发病后12h内静脉滴注1200mg依库珠单抗,并于发病后第3､7天重复给药)和常规治疗组,最终两组各13例获得脑脊液样本并纳入主要终点分析,结果显示,依库珠单抗组与常规治疗组发病后第3天脑脊液C5a水平差异无统计学意义[251(103,402)ng/L比371(131,534)ng/L,P=0.29],且依库珠单抗组1例患者发生白色念珠菌脑膜炎｡综上所述,补体C5在aSAH患者中的疗效及安全性证据尚不足｡
5 血红蛋白降解产物毒性和铁稳态紊乱
5.1 结合珠蛋白及游离血红蛋白
清除通路
aSAH后蛛网膜下腔血肿降解可释放大量细胞外血红蛋白,游离血红蛋白可清除一氧化氮,诱导血管收缩,促进氧化应激和内皮损伤,并进一步产生血红素和游离铁,其为诱导EBI､脑血管痉挛和DCI的重要上游损伤因子[49]｡结合珠蛋白是体内清除游离血红蛋白的关键蛋白,可与血红蛋白形成复合物,限制游离血红蛋白进入脑组织及其氧化毒性[49]｡
Hugelshofer等[50]构建羊侧脑室血红蛋白灌注模型,经左侧侧脑室注入2.5ml血红蛋白(4只)或预先形成的血红蛋白-结合珠蛋白复合物(4只),注入后60min行DSA,结果显示,血红蛋白组4只羊均出现节段性血管痉挛,而血红蛋白-结合珠蛋白复合物组均未出现血管痉挛｡Kawakita等[51]在小鼠SAH造模后30min经侧脑室置管连接皮下微量泵,分别持续泵入结合珠蛋白(30.1mg/ml,8μl/h)或等渗盐水24h,结果显示,与等渗盐水组比较,结合珠蛋白组小鼠SAH后48h病死率更低[0(0/30)比21.1%(8/38)],SAH后24h干湿重法显示脑水肿减轻,纤维蛋白原免疫组织化学显示微血栓减少,Iba-1及原位末端转移酶标记法等检测显示小胶质细胞活化和神经元凋亡减轻,脑血管造影显示脑血管痉挛减轻(均P<0.05)｡鞘内结合珠蛋白进入临床前仍需明确制剂质量､剂量､治疗时间窗及脑脊液药代动力学,理论估算剂量(约3.5g)仅为结合蛛网膜下腔血红蛋白的参考剂量,并非人体推荐剂量[49]｡
5.2 铁负荷､铁蛋白与铁螯合
aSAH后血红蛋白降解可产生血红素和游离铁,过量Fe2+可通过芬顿反应促进羟自由基生成,引起氧化应激､脂质过氧化､线粒体损伤和神经元死亡;铁蛋白是细胞内主要的铁储存蛋白,可缓冲游离铁毒性,其升高提示局部铁负荷增加[52]｡
铁螯合剂去铁胺可结合游离铁,减少铁介导的氧化损伤[53]｡Lee等[53]于大鼠SAH后2､6h腹腔注射去铁胺100mg/kg,此后每12h重复给药至SAH后第3天,结果显示,与未给予去铁胺的SAH大鼠相比,给予去铁胺的SAH大鼠病死率降低[12%(7/58)比29%(21/72),P<0.05],SAH后第3天脑组织非血红素铁浓度降低[(64±17)μg/g比(101±16)μg/g,P< 0.05],8-羟基脱氧鸟苷阳性细胞数[(36±6)个比(90±21)个]和原位末端转移酶标记法染色阳性细胞数[(40±22)个比(162±28)个]均减少(均P<0.01)｡Li等[54]于大鼠SAH造模后2､6h腹腔注射去铁胺100mg/kg,此后每12h重复给药,最长至SAH后7d,结果显示,与对照组(给予等渗盐水;4只)相比,SAH后腹腔注射去铁胺组(4只)造模后第3天皮质伊文思蓝外渗[(3.64±0.82)μg/g比(5.94 ± 0.78)μg/g,P<0.01]及干湿重法测定的脑含水量均降低[(80.6±0.76)%比(83.7±0.45)%,P<0.05],同时免疫组织化学及免疫印迹法显示铁蛋白上调和紧密连接蛋白降解减轻｡上述研究结果表明,SAH后2h开始重复､系统进行去铁胺干预仍可减轻铁毒性､血-脑屏障损伤和脑水肿｡
Galea等[55]对39例aSAH死亡患者及22例对照者(无神经系统疾病及神经病理异常)的尸检脑组织进行铁染色,结果显示,aSAH死亡患者皮质铁沉积由脑表面向深部递减;该研究对21例aSAH幸存者于发病后6个月行头部磁敏感加权成像,结果显示,皮质铁沉积持续存在,入院时血凝块体积可预测发病后6个月灰质铁含量(P=0.013),铁沉积侧别与初始血凝块侧别相关(r=0.55,P=0.013),灰质铁含量与aSAH后认知与情绪评分相关(偏相关系数ρ=0.659,P=0.003)｡Zhang等[56]纳入985例aSAH患者行倾向性评分匹配,结果显示,aSAH后DCI组(104例)入院血清铁水平低于非DCI组[104例;(9.00±6.29)μmol/L比(20.13 ± 8.45)μmol/L, P<0.01],血清铁预测aSAH后DCI的AUC为0.700(95%CI: 0.665~0.733,P<0.01)｡低血清铁与aSAH后DCI相关,但现有研究尚不能据此明确其发生机制或作为补铁依据;去铁胺治疗aSAH的疗效尚缺乏临床证据,上述指标或仅适用于风险分层监测和相关药效学评价｡
6 铁死亡
铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡方式,是aSAH后血红蛋白降解､铁负荷增加和氧化应激共同作用下的重要EBI机制,其主要特征包括游离铁增加､谷胱甘肽耗竭､谷胱甘肽过氧化物酶4活性下降和膜脂过氧化物积累[57-58]｡长链脂酰辅酶A合成酶4可增加细胞膜多不饱和脂肪酸底物含量,提高脂质过氧化易感性;溶质载体家族7成员11参与胱氨酸摄取和谷胱甘肽合成;谷胱甘肽过氧化物酶4是清除脂质过氧化物､抑制铁死亡的关键保护分子[57-58]｡
Cao等[59]在SAH小鼠和细胞模型中应用选择性铁死亡抑制剂Liproxstatin-1,SAH后24h终点实验中,SAH小鼠于造模后4h腹腔注射1次Liproxstatin-1(10mg/kg),SAH后3d终点实验中,SAH小鼠造模后4h开始腹腔注射Liproxstatin-1(10mg/kg),此后均1次/d,连续3d,共3次,对照组给予含5%二甲基亚砜的等渗盐水,结果显示,SAH后24h终点实验中,与对照组比较,Liproxstatin-1组小鼠SAH后24h干湿重法测定的脑含水量更低,Fluoro-Jade C染色示神经元变性减少,丙二醛和4-羟基壬烯醛水平下降;SAH后3d终点实验中,与对照组比较,Liproxstatin-1组给药后第1､2天Garcia神经功能评分均更高,且脑水肿和神经元变性减轻,免疫印迹法显示谷胱甘肽过氧化物酶4表达升高,长链脂酰辅酶A合成酶4和环氧合酶2表达降低,CD68/Iba-1免疫荧光示小胶质细胞活化及炎症因子表达减少(均P<0.05)｡上述研究表明,单次和重复Liproxstatin-1给药均可减轻SAH后EBI,重复给药的保护作用具有持续性｡
Wu等[60]前瞻性纳入210例接受动脉瘤显微外科夹闭术的aSAH患者,根据术后30d改良Rankin量表评分分为预后良好组(0~2分)和预后不良组(3~6分),动态检测术后第1､3､7､30天血清铁死亡相关分子,结果显示,与预后良好组比较,预后不良组各时间点长链脂酰辅酶A合成酶4和IL-6水平均更高,而溶质载体家族7成员11和谷胱甘肽过氧化物酶4水平均更低(均P<0.05),其中长链脂酰辅酶A合成酶4预测aSAH患者预后不良的AUC为0.757,最佳截断值为27.17ng/L,敏感度为70.2%,特异度为68.3%｡铁死亡相关分子已从基础研究逐渐进入临床标志物探索阶段,但目前尚缺乏aSAH患者抗铁死亡药物治疗的相关研究｡
7 总结与展望
目前关于aSAH后EBI相关分子标志物及可干预通路的研究已由相关性观察逐步转向机制验证和靶向干预,但仍以动物实验和小样本探索性研究为主｡部分干预靶点可能有助于改善脑水肿､血-脑屏障破坏､微循环障碍和神经炎症等早期病理改变,但其相关临床研究在剂量､治疗时间窗和终点定义方面存在较大异质性｡本研究所纳入的基础研究多数采用实验性SAH动物模型,并非自发性破裂动脉瘤模型,其病理生理过程与人aSAH存在一定差异,因此相关机制及干预效果向aSAH患者外推时需谨慎｡未来或可以“可检测､可干预､可验证”为目标开展标准化动态监测和分层干预研究,进一步明确相关分子与信号通路在aSAH早期精准治疗中的价值｡