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背景介绍
顺铂及其衍生物数十年来因其形成凋亡性DNA交联的能力而一直是标准化疗药物。然而，支撑顺铂强效抗癌活性的内在亲电性也使其易于与内源性亲核物质（如还原型谷胱甘肽（GSH）、甲硫氨酸和金属硫蛋白）发生非特异性共价结合。结果，仅1-10%的给药剂量到达经典DNA靶点，而大部分被分流至脱靶反应，引发严重副作用和耐药性。虽然这些非预期相互作用传统上被视为主要缺陷，近期研究已将这一问题重新定义为新型铂类药物设计的潜在途径。铂配合物与蛋白质（如铜转运蛋白Ctr1富含甲硫氨酸的N端）结合的能力表明，这些脱靶相互作用可被策略性地重新利用。受这些天然蛋白结合位点启发，新兴铂基疗法目前正以靶向特定疾病相关蛋白为明确目标进行设计。例如，多核铂(II)配合物被设计用于选择性结合人血清白蛋白，而一些N-杂环卡宾（NHCs）靶向天冬酰胺合成酶等酶或与波形蛋白等结构蛋白相互作用。特别是，借助化学蛋白质组学和光交联实现的NHC-铂(II)配合物开发，已鉴定内质网驻留蛋白酪氨酸磷酸酶1B为新的靶点。除铂外，越来越多认识到非铂金属药物通过选择性蛋白结合发挥生物学功能，进一步拓展了蛋白靶向金属药物设计的图景。代表性实例包括靶向Girdin的铱(III)卡宾配合物、靶向拓扑异构酶I/II的钌(II)配合物以及靶向电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的环金属化金(III)配合物，凸显了金属蛋白相互作用作为癌症治疗通用策略的新兴潜力。晶体学研究为铂配合物中金属配位配体如何调控其反应性并引导其与特定蛋白结合提供了宝贵见解。初始识别阶段由铂配合物与蛋白质之间的非共价相互作用介导，配体在塑造铂-蛋白加合物最终结构中起关键作用。在不稳定配体（如氯离子）解离后，铂中心与邻近亲核残基（尤其是组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸）共价结合。级联结合机制已被认为是铂基化疗药物反应性和选择性的关键，但利用这一过程进行合理药物设计仍是重大挑战。一个关键瓶颈在于缺乏能够促进直接高效鉴定铂结合蛋白的定制化学探针，而系统性鉴定蛋白靶点的能力不足仍是推进更精准铂基疗法的关键障碍。
研究思路
针对上述挑战，中山大学毛宗万教授、广东药科大学郑越教授、Qiong Wu教授、国家蛋白质科学中心杨靖教授团队提出并设计了一类含乙烯基磺酰胺亲电基团的铂(II)配合物，通过竞争性化学蛋白质组学技术鉴定丙酮酸激酶M2（PKM2）为Pt1的直接靶点，实现通过分子内蛋白交联诱导铁死亡的非经典铂基治疗策略。团队将兼具配位化学与共价反应性的乙烯基磺酰胺基团引入铂(II)部分，既保留了金属固有配位化学特性，又引入了额外的蛋白靶向能力和更可控的反应性谱。利用定量硫醇反应性分析（QTRP）技术，团队鉴定出Pt1为PKM2 Cys49的共价修饰剂：顺铂部分识别PKM2，触发协同分子内交联事件——铂中心配体交换与周围氨基酸残基协同，同时乙烯基磺酰胺共价锚定至Cys49，从而抑制PKM2寡聚化并促进其核转位。Pt1还在线粒体内蓄积并产生活性氧（ROS），最初诱导线粒体应激并稳定缺氧诱导因子1-α（HIF1-α），该因子与PKM2形成复合物并结合缺氧响应元件（HREs），上调血红素加氧酶-1（HMOX1）表达并破坏铁稳态，最终触发铁死亡。相关内容以Cisplatin Conjugated with Vinylsulfonamide Cross-Links Pyruvate Kinase M2 to Trigger Ferroptosis发表在Journal of the American Chemical Society！
图片解析
图1. 通过半胱氨酸蛋白质组反应性鉴定和验证Pt1靶点：(A) Pt1、Pt2、Pt1a和Pt2a的化学结构；(B) 测试化合物对A2780细胞72 h的细胞毒性（IC₅₀，μM）；(C) QTRP工作流程示意图，A2780细胞用Pt1或L1（10 μM，24 h）处理，n=3，R_H/L值来自L1（轻，红色）与Pt1（重，蓝色）样本中IPM标记肽的MS1色谱峰强度，有效Pt1结合事件定义为R_H/L值<1.0；(D) 通过LC/LC-MS鉴定的部分蛋白命中，R_H/L值<0.7；(E) IPM肽的相对PKM MS1色谱峰强度；(F) SPR法测定Pt1和Pt1a对PKM2结合亲和力的pK_D值，n=3；(G) Pt1或Pt1a（10 μM，24 h）处理A2780细胞中PKM2的CETSA图谱。
图2. 铂(II)配合物对PKM2蛋白的共价修饰：(A-B) 完整蛋白MS评估Pt1和Pt1a与PKM2 WT或C49A蛋白（20 μM）在4℃孵育24 h后的共价结合，变性加合物归一化为最丰富蛋白种类（100%）；(C) 测试化合物的总共价修饰率（%）；(D) Pt1（100 μM）标记的PKM2蛋白（10 μM）Cys49肽段的代表性MS/MS谱。
图3. PKM2与Pt1结合的分子动力学（MD）模拟和结合模式：(A) 50 ns后Pt1修饰PKM2的局部动力学模拟，显示Cys49通过乙烯基磺酰胺共价锚定及铂中心主要配位环境，红虚线表示Pt与Asp347去质子化O原子（Oδ2）、Met330侧链S原子（Sδ）、骨架吡啶N3以及Cys49-SG-CBE共价键之间的距离；(B) Pt-N3(吡啶)、Pt-Oδ2(Asp347)、Pt-Sδ(Met330)和SG-CBE(Cys49)距离随时间的变化；(C) Pt1（100 μM）标记的PKM2蛋白（10 μM）Met330和Asp347肽段的代表性MS/MS谱；(D) 500 ns MD模拟后与Pt1结合的PKM2四聚体代表性构象；(E) 50 ns时Pt1结合位点的代表性特写；(F) 四个链的Cα RMSD；(G) 每个残基的Cα RMSF；(H) 协同靶向结合机制示意图。
图4. (A) PKM2蛋白（15 nM）在有无Pt1、Pt1a和L1（4 μM）下于室温预孵育30 min，在37℃有无FBP条件下监测40 min的丙酮酸激酶活性；(B) Pt1和Pt1a对PKM2二级速率常数（k_inc/K_c）的测定；(C) Pt1处理A2780细胞中PKM2多聚体的DSS交联分析；(D) Pt1（24 h）不同浓度处理A2780细胞核质蛋白裂解物中HIF1-α和PKM2的Western blot，GAPDH和组蛋白H3为内参；(E) Co-IP实验证明Pt1（16、24 μM，24 h）处理A2780细胞中内源性PKM2与HIF1-α的相互作用；(F) 基于DIA定量蛋白质组学的火山图分析，HMOX1以红色突出显示；(G) Pt1、顺铂、Pt1a和L1（24 h）不同浓度处理A2780细胞中HMOX1表达的Western blot分析；(H) PKM敲低A2780细胞中Pt1（16和24 μM，24 h）处理后PKM2、HIF1-α和HMOX1表达的Western blot分析；(I) Pt1诱导PKM2核转位及随后与HIF1-α形成转录复合物上调HMOX1的示意图；(J-K) ICP-MS测定Pt1或顺铂（10 μM，24 h）处理A2780细胞亚细胞组分和基因组DNA中的铂含量；(L) 流式细胞术分析胞内Mito*O₂⁻水平。
图5. Pt1破坏铁稳态并诱导铁死亡：(A) Pt1（16 μM，48 h）处理后A2780细胞的TEM图像；(B) Pt1和Pt1a（24 h）不同浓度处理A2780细胞中NCOA4和FTH1表达的Western blot分析；(C) Pt1（10 μM，24 h）诱导转录组组装unigenes的细胞组分GO分类；(D-F) 流式细胞术分析胞内ROS、LPO、GSH和Fe²⁺水平；(G) Pt1、顺铂、Pt1a和L1（24 h）不同浓度处理A2780细胞中GPX4表达的Western blot分析；(H) PKM敲低A2780细胞中Pt1（16和24 μM）处理后PKM2、ACSL4和GPX4表达的Western blot分析；(I) PKM敲低A2780细胞中Pt1处理后72 h的细胞存活曲线和IC₅₀值；(J) 铁死亡相关基因的GSEA分析；(K) Pt1组与对照组相比的KEGG富集分析；(L) Pt1诱导转录组的生物学过程和分子功能GO分类。
图6. 体内抗肿瘤疗效：(A) A2780荷瘤小鼠模型体内治疗方案示意图，小鼠用生理盐水、顺铂、Pt1和Pt1a（Pt剂量1.5 mg/kg）治疗；(B) 治疗后收集的肿瘤照片，n=5；(C-D) 不同治疗后肿瘤体积变化和最终肿瘤重量；(E) 治疗期间小鼠体重变化；(F) 不同治疗肿瘤模型小鼠肝脏H&E染色，比例尺50 μm；(G) 化合物治疗后第12天荷瘤小鼠生化分析；(H) 不同治疗后肿瘤组织HMOX1和GPX4荧光染色，比例尺100 μm。
结论
该研究将竞争性化学蛋白质组学技术应用于金属药物发现，获得了一种分子内蛋白交联的顺铂偶联物Pt1，利用协同配位-共价策略。在竞争性化学蛋白质组学指导下，PKM2被鉴定并验证为主要胞内靶点。机制研究阐明了Pt1的协同配位-共价结合模型：顺铂部分驱动PKM2结合口袋的快速识别，随后铂中心与周围氨基酸残基发生配体交换，与乙烯基磺酰胺弹头共价结合Cys49协同作用，这种双重锚定机制最终赋予卓越的结合亲和力和加合物稳定性。具体而言，QTRP分析共定量2286个半胱氨酸（来自1413个蛋白），696个蛋白在至少两个重复中检出，通过严格筛选（R_H/L<0.7）将铂引导靶点缩小至8个，PKM2（R_H/L=0.57）被优先用于后续验证；SPR显示Pt1和Pt1a对PKM2具有亚微摩尔结合亲和力，而反式铂类似物Pt2和Pt2a亲和力可忽略，表明顺式铂配位几何是靶点识别的严格结构前提；完整蛋白MS显示Pt1与PKM2 WT孵育产生两个不同加合物峰（+462.2和+933.7 Da），总修饰丰度达76.7%，显著高于Pt1a的35.5%，而C49A突变体使Pt1a修饰丰度增至63.4%（与Pt1的71.4%相当），且C49A突变体二加合物峰丰度（18.5%）较WT（34.3%）减半，证实Cys49参与共价修饰过程；pFind3鉴定的主要质量偏移为462.077 Da（=539），并明确鉴定Cys49为共价修饰位点；分子动力学模拟揭示Met330/Asp347模型在500 ns模拟中保持Pt-N3(吡啶)、Pt-Sδ(Met330)和Pt-Oδ2(Asp347)配位及Cys49-SG-CBE共价连接稳定。功能上，Pt1共价修饰严格阻碍PKM2寡聚化，驱动其核转位，与HIF1-α相互作用并随后上调HMOX1，这一级联导致胞内铁过载并伴随线粒体应激，从而协同触发肿瘤特异性铁死亡——Pt1处理细胞呈现铁死亡特征性线粒体形态（线粒体皱缩、膜密度增加、嵴减少），Fe²⁺大量蓄积，ROS和脂质过氧化物急剧积累，GSH快速消耗，GPX4显著下调；HMOX1抑制剂ZnPP显著减弱Pt1诱导的Fe²⁺激增；PKM2敲低使A2780细胞对Pt1的敏感性显著降低（72 h IC₅₀从10.73±0.42 μM增至18.64±0.79 μM）；DIA蛋白质组学显示HMOX1、金属硫蛋白-1X（MT1X）、金属硫蛋白-2A（MT2A）、生长分化因子15（GDF15）和铁蛋白轻链（FTL）上调，而顺铂组主要表现p53（TP53）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（CDKN1A）上调，表明Pt1和顺铂引发不同的细胞应激反应。在A2780卵巢子宫内膜样腺癌皮下异种移植模型中，Pt1（Pt剂量1.5 mg/kg，第0、3、6、9天尾静脉注射）使肿瘤体积相对对照组减少71.4%，与顺铂的80.7%相当，尽管Pt1体外细胞毒性低于顺铂；H&E染色显示Pt1a和顺铂诱导肝组织弥漫性嗜酸性增强（早期亚致死性肝细胞应激），而对照组和Pt1组无此改变；血清生化分析显示Pt1组肝损伤标志物ALT、AST和肾损伤标志物CREA、BUN水平低于Pt1a和顺铂组；肿瘤组织免疫荧光显示Pt1治疗显著上调HMOX1并下调GPX4。研究指出，尽管Pt1为PKM2靶向配位-共价结合提供了机制概念验证，但其体外和体内抗癌效力有限，目前更可能作为机制研究的有用工具化合物，未来优化连接乙烯基磺酰胺弹头与铂中心的配体骨架可能改善PKM2靶向并增强抗肿瘤疗效。该工作为利用共价靶向的非经典铂基治疗药物设计建立了合理方法。