重性抑郁障碍（major depressive disorder, MDD）与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）在临床与临床前研究中均被证实存在关联，有效治疗抑郁或可延缓部分AD的发生。菌群-肠-脑轴的功能障碍通过失调的微生物代谢物参与MDD与AD的发病；天然二氢查尔酮类化合物Trilobatin（TLB）具有神经保护作用并可调节肠道菌群，但其能否通过重建肠道微生态与代谢物谱改善抑郁样行为与认知障碍，此前尚无明确答案。来自遵义医科大学的研究团队在《Phytomedicine》发表的文章揭示：TLB可直接结合Nrf2并增强Nrf2-ARE活性，同时重塑肠道菌群、提高Akkermansia muciniphila（AKK）丰度与短链脂肪酸水平、强化肠屏障紧密连接，最终改善LPS诱导的抑郁样行为与认知障碍。
研究首先在LPS诱导的小鼠模型中评估TLB的行为学效应，并以一线抗抑郁药氟西汀（10 mg/kg）作为阳性对照（图1A）。TLB（5、10、20 mg/kg）或氟西汀经灌胃给药7天；除对照组外，各组每日腹腔注射LPS（250 μg/kg）共7天，每组n=10。旷场试验显示，各剂量TLB对小鼠自主活动与总路程无明显影响（sFig. 1），TLB单独给药也未改变其他行为指标，排除了结果受运动能力或药物非特异性效应干扰的可能。与对照组相比，LPS组出现典型的抑郁样表型：糖水偏好率下降（图1B）、强迫游泳与悬尾实验不动时间延长（图1C, 1D）、社交互动区停留时间缩短（图1E）；与LPS组相比，TLB各剂量组上述指标均剂量依赖性改善，其效应与氟西汀相当。认知方面，与LPS组相比，TLB组Y迷宫自发交替率提高（图1F）、新物体识别（NOR）指数回升（图1G）。各剂量中20 mg/kg的效应最为稳定，因此后续实验统一采用该剂量。
图1 Trilobatin改善LPS诱导的抑郁样表型与认知缺陷
为确定TLB作用的细胞靶点，研究对小鼠海马组织进行单细胞转录组测序：LPS组分析24,323个细胞、TLB补充组分析27,544个细胞，每组3只小鼠（图2A）。无监督聚类得到23个细胞类群，对应小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、T细胞、内皮细胞、粒细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、B细胞与单核细胞等10类中枢神经系统细胞（图2A, 2B）。针对表达经典标志物（Gja1、Aldh1l1、Gfap、Aqp4）的星形胶质细胞，研究进一步分析其异质性亚群：伪时序分析显示cluster 2星形胶质细胞在TLB发挥行为学改善作用时显著扩增（图2C），Nrf2的编码基因Nfe2l2是该亚群最主要的差异表达基因（图2D）；对该亚群（n=2357个细胞）作Ingenuity通路分析（IPA）显示，其富集通路涉及Nrf2介导的抗氧化反应、线粒体功能障碍与NF-κB驱动的神经炎症（图2E）。上述结果表明，TLB的作用细胞为海马星形胶质细胞，信号指向Nrf2/ARE通路。
图2 单细胞测序评估Trilobatin经Nrf2/ARE通路对星形胶质细胞的作用
TLB与Nrf2能否直接结合，随后研究通过计算模拟、离体结合实验与在体验证三个层面逐一分析。分子对接显示TLB（黄色）嵌入Nrf2（蓝色）的结合口袋，结合能为−10.28 kcal/mol，与His575（3.0 Å）、Arg336（2.4 Å）、Glu35（2.5 Å）与Asp38（2.0 Å）形成4个氢键，其结合亲和力优于结构类似物（−3.36 kcal/mol）与氟西汀（−4.45 kcal/mol）（图3A）。二维与三维吉布斯自由能景观图（图3B, 3C）、100 ns分子动力学模拟中复合物骨架RMSD在平衡后稳定于2.0 Å以内（图3D）以及结合位点残基的RMSF小于0.5 Å（图3E），共同支持该结合构象的稳定性；表面等离子体共振（SPR）测得TLB与Nrf2的解离常数KD为5.58×10⁻⁷ mol/L，证实两者直接结合（图3F）。功能层面，凝胶迁移实验（EMSA）显示TLB剂量依赖性增强Nrf2-ARE结合活性，在20 mg/kg时达到峰值（图3G, 3H）；海马组织印迹显示，与LPS组相比，TLB组细胞质Nrf2水平下降而细胞核Nrf2水平升高，提示核转位增强（图3I, 3J），同时Keap1表达下调、下游抗氧化酶NQO1与HO-1表达上调（图3K, 3L）。从直接结合、核转位到下游抗氧化基因激活，TLB作为Nrf2直接激动剂的分子身份得以确认。
图3 Trilobatin直接结合Nrf2并激活Nrf2-ARE结合活性
分子靶点确立后，研究进一步评估了TLB对肠道菌群与肠屏障的影响（图4A）。对小鼠粪便进行16S rRNA测序，α多样性分析显示各组间Chao1与Shannon指数无显著差异（sFig. 6），而β多样性主坐标分析（PCoA）显示三组菌群结构明显分离，PCo1与PCo2分别解释25.62%与15.02%的变异（图4B）。门与属水平的组成分析显示，LPS引起菌群失调，表现为Firmicutes升高、Bacteroidetes降低，Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值升高；与LPS组相比，TLB组的F/B比值回落至接近基线水平（图4C–E，每组n=5）。LEfSe分析进一步显示，LPS促进了包括Escherichia在内的促炎性Firmicutes富集、减少了包括AKK与Muribaculaceae在内的有益菌群；TLB干预逆转了上述改变，其中AKK丰度提升尤为明显（图4F）。肠屏障方面，回肠HE染色显示LPS组出现绒毛结构破坏，TLB组黏膜结构与上皮完整性明显改善（图4G）；透射电镜显示LPS组紧密连接结构损伤、微绒毛形态异常，TLB处理后紧密连接超微结构得以保护（图4H）；与LPS组相比，TLB组回肠claudin、occludin与ZO-1蛋白表达显著升高（图4I–K，每组n=5）。菌群被重塑的同时，肠道物理屏障也得到修复，二者构成TLB经菌群-肠-脑轴发挥作用的上游环节。
图4 Trilobatin逆转LPS诱导的肠道菌群失调并保护肠屏障
图5 Trilobatin经菌群-肠-脑轴的获益依赖Nrf2（粪菌移植实验）
短链脂肪酸（SCFAs）是菌群调控宿主免疫与神经功能的关键代谢物，研究对粪菌移植实验小鼠的粪便SCFAs谱作靶向代谢组学分析。三维与二维主成分分析显示对照组、LPS组与FMT+LPS组的SCFAs谱可清晰分离（图6A, 6B），层次聚类（图6C）与色谱图（图6D）进一步给出组间差异与定量基础。定量结果显示，与对照组相比，LPS组乙酸（图6E）、丙酸（图6F）、丁酸（图6G）、异戊酸（图6J）与戊酸（图6K）水平明显下降；与LPS组相比，FMT+LPS组上述5种SCFAs水平均显著回升，其中异丁酸（图6H）在LPS处理后降低而移植后未见回升，提示SCFAs的恢复具有选择性。相关性分析显示，粪便SCFAs水平与脑内线粒体促炎因子及氧化应激指标呈负相关，与抗氧化酶SOD2、GPx1活性呈正相关（图6M）。上述结果提示，TLB经菌群提升特定SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸与戊酸），可能通过协同抑制神经炎症与氧化损伤参与其神经保护作用。
图6 Trilobatin对小鼠短链脂肪酸生成的影响
菌群代谢物中单一菌种的因果作用，由AKK补充实验直接验证。研究给LPS小鼠每日灌胃活AKK（1×10⁹ CFU/mL）连续7天，AKK给药后再腹腔注射LPS，实验设对照、LPS与LPS+AKK三组（图7A–G）。与LPS组相比，AKK补充改善了抑郁样行为：糖水偏好回升（图7A）、强迫游泳与悬尾不动时间缩短（图7B, 7C）、社交互动时间延长（图7D）；Y迷宫与NOR的探索轨迹显示空间探索能力恢复（图7E），自发交替率（图7F）与识别指数（图7G）显著回升。菌群层面，AKK补充提高了Chao1（图7H）与Shannon（图7I）α多样性指数，改变了β多样性（图7J）与门、属水平的菌群构成（图7K, 7L），并降低Firmicutes/Bacteroidetes比值（图7M）、改变差异富集分类群（图7N，每组n=5）。分子层面，海马免疫印迹显示AKK补充促进Nrf2核转位并降低Keap1表达（图7O–R）；回肠免疫组化显示Claudin-1、Occludin与ZO-1表达升高，肠屏障完整性得以维持（图7S–W，每组n=5）。单一菌种的补充即可复现TLB的核心效应（图7X），提示AKK是经Nrf2通路发挥作用的关键菌群中介。
图7 Akkermansia muciniphila经激活Nrf2信号调节菌群并发挥保护作用
综合上述结果，本研究提出的机制模型是（图8）：LPS暴露诱导神经炎症与肠道菌群失调；TLB直接结合Nrf2并促进其核转位、增强Nrf2-ARE转录活性，抑制神经炎症与氧化应激；同时TLB重塑肠道菌群、提升AKK丰度与SCFAs水平、强化肠屏障紧密连接；菌群来源的代谢信号经Nrf2依赖的菌群-肠-脑轴进一步放大中枢保护效应，抑郁样行为与认知障碍随之改善。
图8 Trilobatin经Nrf2激活与菌群重塑改善LPS诱导抑郁样行为与认知障碍的机制总结
醉翁之艺点评
该研究以氟西汀为阳性对照、以Nrf2基因敲除小鼠为门控条件，并通过粪菌移植与AKK单菌补充两组实验相互印证，把分子靶点、肠道菌群与中枢保护接成了一条依赖Nrf2的轴线。研究首次提出星形胶质细胞Nrf2可调控菌群-肠-脑轴，并据此影响MDD合并AD中的神经炎症-氧化应激恶性循环。研究先用单细胞测序锁定细胞靶点，再以分子对接与 SPR 印证直接结合，避开了天然产物研究中常见的靶点不清问题。TLB作为天然Nrf2激动剂具备一定成药潜力：其本身是天然食品添加剂，已被认定为GRAS（generally recognized as safe，一般认为安全），AKK作为益生菌补充的可行性也在本研究中得到验证，为药物联合益生菌的干预策略提供了实验依据。但需注意，LPS急性模型尚难以完全模拟人类MDD与AD的慢性、多因素病理，直接临床转化还需进一步研究探索。在麻醉与围术期，术前肠道菌群状态是否影响术后认知结局，值得在围术期神经认知障碍的研究中继续跟进。